BRAF遺伝子変異解析の内容及び目的と意義
尿沈渣を用いた移行上皮癌・前立腺癌のDigital PCRによるBRAF遺伝子変異解析検査
サンリツセルコバ検査センターでは、東京大学動物医療センターとの連携により、犬の移行上皮癌及び前立腺癌における尿沈渣もしくは前立腺マッサージ液沈渣を用いたBRAF遺伝子変異検査を受託しております。
BRAF遺伝子の変異は人の悪性黒色腫や大腸がんに認められる遺伝子変異であり、遺伝子検査法が確立されています。犬においては膀胱移行上皮癌及び前立腺癌に高率（60～80%）に認められることが近年判明し、この度日本でもはじめて尿沈渣を用いたDigital PCRによる遺伝子診断を提供できることとなりました。私達が提供する高感度の手法により、尿中に存在するごく少数のBRAF遺伝子変異を持つ腫瘍細胞を検出することができます。
BRAF遺伝子変異とは
犬や猫における肥満細胞腫の発生にはc-KIT遺伝子の変異が深く関わっています。これらの変異は正常な細胞には認められず、遺伝子変異によりc-KIT分子が恒常的に活性化することでがん細胞の増殖を促進すると考えられています。
2015年に、同様の遺伝子の変異が犬の膀胱移行上皮癌と前立腺癌にも発見されました1), 2)。それがBRAF遺伝子の変異です(図1)。
この遺伝子変異は尿路の移行上皮癌と前立腺癌の約70-80%で認められ、また悪性腫瘍以外の正常組織や炎症性疾患、移行上皮乳頭腫等の病態ではこの遺伝子変異は認められないことが確認されています(図2)。
尿沈渣・前立腺マッサージ液沈査を用いたBRAF遺伝子変異解析検査について
尿路移行上皮癌や前立腺癌では尿中や前立腺マッサージ液中に腫瘍細胞が剥離してきます。これを利用したものが本BRAF遺伝子変異解析検査です。これらの検体に含まれる細胞から遺伝子を抽出し検査を行うことで、BRAF遺伝子の変異の有無を確認します。もしも腫瘍を疑う症例であって、沈査中の細胞から抽出したBRAF遺伝子に変異が認められる場合は、移行上皮癌もしくは前立腺癌である可能性が極めて高いと考えられます。しかし、悪性腫瘍の中にもBRAF遺伝子に変異を持たない悪性腫瘍が20~30%存在しますので遺伝子変異が陰性であることは悪性腫瘍を否定する結果ではないことに注意が必要です。
このようにBRAF遺伝子変異解析検査は犬の尿路移行上皮癌及び前立腺癌の確定診断補助ツールとして有用ですが、単独で確定診断の根拠とすることはできません。診断に際しては、他の検査所見、特に細胞診（もしくはセルパック）検査所見と合わせて判断することが大切です。
Digital PCR法を用いた検査について
尿沈査・または前立腺マッサージ沈査中から腫瘍の変異遺伝子を正しく検出するためには非常に高感度の検査法が必須です。なぜなら、尿路移行上皮癌や前立腺癌の症例では強い感染や炎症を伴っていることが少なからずあり、このような場合には数百個のBRAF変異を持たない炎症細胞に数個のBRAF変異腫瘍細胞が希釈されています。
私たちはいくつかの方法を検討してDigital PCR法が最も高感度に遺伝子変異を検出できることを明らかにしました（図３）。通常のシークエンスや制限酵素を使った方法では偽陰性となってしまうような症例に対してもDigital PCR法は有効であり、300個に1個の腫瘍細胞を検出することが可能です。
また数千～二万の遺伝子を個別に解析するため、検体採取や検査中の予期せぬエラーやコンタミにも気づくことができます。
BRAF遺伝子変異検査検体採取・送付について
受付から7日前後
①尿沈渣
②前立腺マッサージ液沈渣
（①、②いずれも遠心後、上清を捨てて冷凍保存）
（容器は密閉性の高いスクリューキャップチューブまたはエッペンチューブ。スピッツ菅は冷凍条件で漏れることがあるので不可）
③腫瘍組織
（生検体のまま冷凍保存、生食には浸漬せず、そのままチューブに入れて冷凍保存）
※備考
（a）検体量が足りない場合、検査ができない場合があります。
（b） 検体材料の詳しい採取、処理方法及び送付方法は「BRAF遺伝子検査検体採取・送付について」の資料をご覧ください。
お問い合わせ
受付先およびお問い合わせ（検査日数・料金等に関して）
検査結果に関するお問い合わせ
東京大学 動物医療センター 遺伝子検査部
TEL：03-5841-1603
対応時間：月曜日～金曜日の13：00～16：00）
E-mail：
※ご依頼者のご了解なしにお預かりした検体を研究利用することはありません。
依頼書ダウンロード
※ダウンロードボタンをクリック後、表示されたPDFファイルはパソコンで簡単に記入できますので、記入方法にしたがってご記入後、プリントアウトしてください。
よくあるご質問
検体採取について
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サンプルはどのようなものがどのくらいあればよいですか？
▲尿沈渣、破砕性カテーテル法で採取した検体の遠心物などが利用できます。
▲いずれも細胞が数万個～あれば正確な検査が可能です。スピッツ管で作成した尿沈渣であれば1mm厚程度あれば十分ですが、検査依頼前に一部の検体を塗沫・鏡検し十分量の細胞が含まれていること（肉眼・低倍率でも細胞集塊の十分な広がりを確認できる程度）を確認しておくことを強くお勧めします。
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検体の保存はどのようにすればよいですか？
▲液体検体（尿沈渣・前立腺マッサージ液）の場合は、遠心し上清を捨てて沈渣だけにして、冷凍保存/発送してください。腫瘍組 織の場合はそのまま冷凍保存/発送してください。
▲沈渣は密閉性の高いスクリューキャップチューブまたはエッペンチューブに入れて送付してください。スピッツ管はもれる ことがあるので、送付には使用しないでください。
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尿全体を冷凍しても検査はできますか？
▲基本的には不可能です。尿中に核酸が漏出し、十分な濃度の検体が得られなくなります。
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検体が不十分であった場合、途中で連絡をいただけますか？
▲残念ながらできません。Digital PCR検査の性質上、最終段階になってから検体量が十分であったか確定するためです。そのため検体中に十分な細胞が存在するかどうかを検査依頼前に確認することが重要です。
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猫の検査もできますか？
▲猫では本遺伝子変異は報告されておらず、検査はできません。
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細菌感染が あっても、検査できますか？
▲Digital PCRは非常に感度の高い方法です。ある程度の細菌の混入であれば問題なく検査を行うことできます。
▲菌数が著しく多いために細胞の含まれる率が下がってしまう場合や膿様になり細胞成分が変性してしまっている場合などに ついては正しい結果が得られない場合もあります。
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細菌感染が あっても、検査できますか？
▲Digital PCRは非常に感度の高い方法です。ある程度の細菌の混入であれば問題なく検査を行うことできます。
▲菌数が著しく多いために細胞の含まれる率が下がってしまう場合や膿様になり細胞成分が変性してしまっている場合などに ついては正しい結果が得られない場合もあります。
検査結果について
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検査結果が陽性でした。どのように考えればよいですか？
▲移行上皮癌もしくは前立腺癌である可能性が極めて高いです。これまでの報告ではBRAF遺伝子変異が陽性であって、良性疾患であった症例は存在しません。しかし、まだ症例数の蓄積が少ない新規の検査法であるため、今後例外的な症例が発見される可能性があります。したがってその他の臨床検査所見と合わせて最終的にはご判断ください。
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検査結果が陰性でした。どのように考えればよいですか？
▲悪性腫瘍を含め全ての疾患（もしくは正常）の可能性があります。これはBRAF遺伝子に変異を持たない移行上皮癌や前立腺癌も20~30%存在するためです。その他の臨床検査所見と合わせて判断してください。
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検査結果が検体不足でした。どのようにすればよいですか？
▲検体中に十分な細胞がいなかったということを意味しています。肉眼的な沈渣中に含まれていた成分が多量の結石であったケースなどが考えられます。これらは検査前に一部を塗沫・鏡検することで回避できます。また通常の採尿では細胞数が少なすぎる場合は、生理食塩水で膀胱内を複数回潅流する、破砕性カテーテル法を追加する等の方法で検体量を増やすことができます。
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報告書に記載された「変異遺伝子の割合」にはどのような意味がありますか？
▲一般的に腫瘍細胞が多く含まれていると高く、強い感染等を伴い炎症細胞が重度に存在する場合には低くなります。0.15%以上であればどちらも陽性には変わりません。結果を同時に実施した細胞診と照らし合わせることで、検査結果間の比較をすることができます。
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報告書に記載された「解析遺伝子数」にはどのような意味がありますか？
▲Digital PCR法の感度と特異度を十分に保つためには2,000-20,000の遺伝子が解析されることが望ましいと考えられます。ただしそれ以外の場合であっても、検体の内容次第（例えば検体中の細胞数は200個しかなかったが明らかに変異遺伝子が存在している）では、検査結果に結びつく場合もありますので、報告書の結果やコメントを参照してください。
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BRAF遺伝子変異陽性の場合にはc-KIT変異に対するイマチニブ/トセラニブのような分子標的薬があるのでしょうか？
▲現在獣医領域でBRAF遺伝子変異腫瘍に対して有効と考えられる薬剤の報告はありません。ヒトのBRAF遺伝子変異腫瘍に対しては分子標的薬が複数認可されていますが、これらが犬のBRAF変異腫瘍に効果があるかどうかに関しては全く情報はありません。
